V.T.PhamandM.H.Mohajri.Thapplicationofinvitrohumanintstinalmodlsonthscrninganddvlopmntofpr-andprobiotics.BnfMicrobs.Apr26:1-18.

▌介绍

人体内有大量的微生物，其中胃肠道是迄今为止最大的定植器官，其包含的不同节段具有不同环境条件和微生物谱，这反映在细菌细胞的分布不均，胃和十二指肠细菌浓度低（每克10^1至10^3个细菌），在空肠和回肠中增加至每克10^4至10^7个细菌，结肠中浓度最高（每克10^11至10^12个细菌）。结肠含有人体中所有微生物的70％以上。消化物质的缓慢流动为细菌提供了发酵来源于饮食和内源性分泌物的未消化的底物以增殖的时间，因此，人类肠道是一个大型、多样化和动态的细菌群落的自然栖息地，迄今为止描述的细菌种类超过1,种。最近的分析表明，我们体内的细菌数量与人类细胞总数相同，并且含有比人类基因组多倍的基因。需注意受年龄、性别、饮食、疾病、药物和环境等影响，个体之间的微生物组成存在显着差异。人们早已认识到并记录了这个庞大而动态的细菌群落对宿主健康和疾病的意义及影响。在早年生活中，肠道菌群的定植及代谢与胃肠疾病的病因相关，如婴儿腹痛和坏死性小肠结肠炎。人类肠道微生物群在免疫系统的发育和稳态中发挥着重要作用，并可能与多系统器官衰竭、结肠直肠癌、炎症性肠病（IBD）和肥胖等特定病理状况有关。此外，肠道微生物群与神经系统之间的关系也日益显著。因此，人们有机会通过开发益生菌和益生元干预来调节肠道微生物以获得长期持久的健康。

益生菌被定义为“一种活的微生物，在给予足够剂量时，对宿主健康有益”。益生菌发挥其有益作用的机制包括改变肠道微生物群、竞争并限制病原体的定植、增强上皮屏障功能和调节免疫系统。益生元最初定义为“不易消化的食物成分，通过选择性刺激结肠中一种或少数几种细菌的生长和/或活性对宿主产生有益影响，改善宿主健康”。经过20年的研究，益生元的概念已获得发展，定义已被多次完善。益生元的最新定义是“宿主微生物选择性利用的底物，赋予宿主健康益处”。一些关键性的研究总结了益生元和益生菌在总体健康、结直肠癌、IBD和肥胖中的作用。在这篇综述中，我们讨论了体外肠道模型是作为益生元和益生菌研究的有用方法及最常用模型的优缺点和技术问题。此外，我们对应用这些模型进行益生元和益生菌研究的文献进行了总结。

▌体外人类肠道模型是益生元和益生菌发展的有力工具

在益生元和益生菌的研究中，体外和体内研究之间的整合是必要的，可以互相补充。下面将讨论每种方法的优点和缺点。

人体研究

人体研究可利用粪便样品，它能初步反应胃肠道微生物组成。这种类型的研究还能够建立微生物群组成与宿主表型或环境之间的相关性，产生研究问题，或者可以用来确认在简化模型中观察到的效应或机制。

营养化合物对肠道微生物群的影响可以通过给予人类受试者过量的测试成分来证明，但可能导致不良反应。因此，介于道德及安全问题，这些研究往往受到限制。而且，很难监测和严格遵守介入治疗。新的数据也提供了结肠微生物群能快速适应底物可用性改变的证据。在人体研究中，取样大多限于粪便探针作为终点测量。由于侵入性和不方便操作，从胃肠道不同区域（例如近端结肠）获取样品受到限制，因此难以准确确定起效的部位，及进一步确定益生元和益生菌的作用机制。肠道上皮细胞分泌形成粘液层，将肠腔和宿主组织分开。然而，粘液层的采样是侵入性的，粪便样品的使用无法代表粘膜群落。在人体研究中，由于宿主-微生物群之间不可避免的相互作用，益生元和益生菌对肠道微生物活性的直接影响通常难以解释。人体研究的另一个挑战是由遗传背景、饮食、健康状况、生活方式和环境条件等混杂因素引起的巨大的个体差异。最后，难以确定益生元和益生菌对肠道微生物群组成的影响是通过直接刺激生长或是通过微生物群短链脂肪酸（SCFA）（可降低pH）的产生。

动物研究

动物模型（主要是小鼠、大鼠和小猪）使我们可以在高度控制的环境下调节和研究宿主-微生物相互作用，从而将人体研究中常见的混杂因素的影响降至最低。其中无菌动物是研究肠道微生物对宿主功能影响的最适合的模型。处死动物后我们可以直接获取结肠内容物，结肠内容物中的细菌代谢物例如SCFA还没有被宿主吸收，因此与使用粪便的研究相比，动物试验更适合于研究肠道微生物群的代谢活性。

最近一项使用新生仔猪模型的研究证明了低聚半乳糖（GOS）对肠道功能的影响，如促进肠道微生物群平衡，改善肠道组织形态和刺激肠道免疫系统。一般而言，动物模型在营养干预例如肠胃外营养、低聚糖、益生元和益生菌的筛选方面具有优势，并能进一步阐明其作用机制和对宿主的影响，鉴定微生物和宿主生物标志物，这些在非侵入性婴儿研究是不可能做到的。然而，动物模型是昂贵的，劳动密集的，并且在生理学上可能不能代表人体代谢。另外，动物的微生物组不同于人类的微生物组，因此，将从动物模型获得的发现转用于人类仍然是一个挑战。

体外肠道发酵模型

为了克服体内研究的这些缺点，人们开发了体外发酵模型，作为在高度控制的条件下研究人类肠道微生物群的有力工具，它使我们能够在模拟不同结肠区域的反应器中随时间动态取样。

与体内研究相比，体外结肠发酵模型更便宜，可重复性更高，不需要经过精心准备伦理批准，并且可以在更短的时间内进行研究。这些模型能够在模拟的生理条件下培养来自粪便样品的人类肠道微生物群。几种模型还可以进一步模拟酶消化活性、粘液生成以及微生物群和宿主之间的相互作用。因此，研究人员能够使用这些系统来研究益生元和益生菌对肠道微生物群的影响、益生元的发酵谱、益生菌在整个胃肠道的生存能力和功能。体外发酵模型不仅可用于筛选和开发不同的益生元及益生菌，还能用于机制研究，并在碳水化合物和蛋白质发酵、类固醇和胆汁酸代谢、氢气形成和清除领域形成假设。

体外发酵的原理是在生理条件下（厌氧生活、保留时间、培养基、温度和pH）将粪便微生物群接种在营养培养基中。最简单的模型是分批发酵，由于底物的快速消耗和pH的降低（抑制微生物活性），适用于短期实验。另一方面，具有不同复杂程度的连续培养可允许长期发酵和参数调整以模拟体内条件。单阶段模型通常模拟近端结肠的条件，而多阶段发酵模型可以模拟结肠的不同区域（近端结肠、横结肠和远端结肠）。

考虑到每种方法的优点和局限性，将体外和动物模型与人体研究相结合设计多尺度的策略可能有助于深入了解肠道微生物群，饮食和宿主之间的复杂关系;并进一步阐明肠道微生物群在健康和疾病中的作用。

▌体外人类肠道模型的重要参数

粪便接种

胃肠道不同区域具有不同环境条件和微生物特征。因此，模拟一个区域（例如近端结肠）的模型最好应接种该特定区域的生物学内容物。然而，收集此类样品需要侵入性的操作，导致了伦理的约束，因此大多数体外结肠发酵模型接种的是粪便样品。尽管如此，理论上通过选择专门的发酵培养基，仍然可以模拟胃肠道中所需区域的条件。需注意，使用粪便样品可能会将额外的未定义的底物引入系统中。为了减少底物污染物的影响，粪便样品经常短暂离心以去除大颗粒。此外，在确定的发酵培养基中分批发酵粪便接种物将进一步促进粪便微生物群适应特定结肠区域的实验条件。

考虑到由性别、饮食、地理位置、种族和年龄引起的粪便供体者之间的个体间差异，来自不同供体的粪便样品在接种到体外系统之前是否应该汇集仍然存在争议。有利于汇集微生物群的争论是汇集可以限制个体间变异性并提供可以重复用于不同发酵的标准化微生物群，便于实验之间的比较。值得注意的是，随着时间的推移，除个体差异之外，同一个供体内的差异也可能导致不同的微生物群组成和代谢活性。此外，汇集粪便样品会增加总体多样性并导致更广泛的肠道微生物谱。最近一项使用TIM-2系统的研究比较了来自单个供体和四个供体的肠道微生物群的稳定性和活性。作者强调了单个供体在多样性和功能方面与多个供体相似，这表明粪便样品的汇集适合用于发酵实验。

另一方面，支持使用个体接种的主要观点是，混合接种物中不同功能细菌群的混合可能干扰每个供体个体中建立的重要交叉互生和营养链，从而可能导致结果不同于个体接种。

pH值

结肠pH对肠道微生物群的组成和代谢活性有着深远的影响。重要的是，pH能影响益生元发酵关键酶的活性。Palframan等人证明了在不同pH条件下双歧杆菌对低聚果糖（FOS）、菊糖、异麦芽低聚糖（IMO）、GOS和乳果糖的作用不同。这支持了益生元组合的构想，使益生元在在结肠的不同部位起作用。在受控和不受控制的pH周期下，固定化婴儿粪便细菌的连续发酵证明了大多数细菌群体，特别是双歧杆菌属种对pH值的变化的高度敏感性。在使用了接种成人粪便微生物群体的单级发酵系统的研究中，将pH从6.5降低至5.5促进了丁酸盐的产生，增加了产丁酸盐细菌的水平，并且抑制了类杆菌属种的生长。一项研究利用接种来自四名成年供体的粪便浆液的分批培养物，研究pH值（5.2、5.9和6.4）对乳酸盐产生和利用的影响，结果表明，pH5.2诱导乳酸盐积聚，这是由于乳酸盐利用率降低。ZihlrBrnr等人使用接种了3名儿童（6、8和10岁）的肠道菌群的连续PolyFrmS肠模型，研究pH的影响。该研究表明，pH值从5.7降至5.5导致丁酸酯产量增加、乙酸浓度降低以及总代谢活性降低。0.2个单位的pH下降也导致了拟杆菌属成员的相对丰度降低，产丁酸盐菌的相对丰度增加。最近的一项研究表明，pH对来自不同分类细菌之间的竞争有很大的影响，这些细菌有利用相同多糖的能力，在菊糖作为唯一碳水化合物的反应器中，拟杆菌属16SrRNA基因拷贝的百分比从pH6.9的60％降至的pH5.5的30％。

滞留时间

滞留时间在肠道菌群的发酵过程中起着重要作用。使用三阶段连续模型（Rading模型）在体外研究滞留时间的影响。该研究表明，与60小时相比，将滞留时间降低至20小时导致乙酸酯增加和丁酸酯产量降低。重要的细菌群如瘤胃球菌属和产丁酸的罗氏弧菌在20小时的滞留时间完全从系统中移除，这表明它们的生长不够迅速以保持在生态系统中。滞留时间不仅影响碳水化合物的发酵，对于肠道细菌对蛋白质的降解也可能是重要的，来自三阶段连续模型的数据表明，酶活性、蛋白质浓度、氨和苯酚产量与滞留时间同步增加。通过使用相同的肠道模型，MacFarlan等人发现，将滞留时间从27.1小时改变为66.7小时可增加蛋白质降解和氨基酸发酵。在最近的一项研究中，将滞留时间从正常48小时改为96小时，导致生物量和总细菌数量减少。此外，在该模型系统中，延长的滞保留时间降低了横向和远端隔室的肠道微生物群多样性，同时导致近端结肠中碳水化合物发酵增加为主的代谢转变。

在最近的一篇综述中还详细讨论了体外人类肠道模型中涉及的其他参数，如氧化还原电位和厌氧生物学，本文不包括这些参数的讨论。

▌体外分批发酵模型

强调每个体外模型具有的特定优点和/或缺点是很重要的。体外模型的选择取决于实验的目的（图1，请参见原文）。我们在下文讨论不同模型的优点、缺点和技术问题，并

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